形質転換法（塩化カルシウム)

　プラスミドＤＮＡを細胞に導入することを形質転換といい、ＤＮＡを取り込み易くなった細胞をコンピテントセルという。大腸菌のコンピテントセルは対数増殖期の細胞を塩化カルシウム溶液で処理することによって得られる。さらにコンピテントセルをＤＮＡ存在下で熱処理するとＤＮＡの取り込みが促進される。ｐＵＣ等のプラスミドを取り込んだ大腸菌はアンピシリン耐性となりアンピシリンを含む寒天培地でコロニーを形成することができる。さらにＤＮＡ断片を組み込んだプラスミドを持つ大腸菌は、ガラクトシダーゼの発現を指標にコロニーの色で識別することができる。

準備：

ＬＢ液体培地
ＬＢ＋アンピシリン平板寒天培地；50μg/mlの濃度のアンピシリンを含むＬＢ培地。
５０mM塩化カルシウム溶液；あらかじめ氷冷しておく。
X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indory-D-galactoside)溶液：dimethylformamidoに20mg/mlの濃度で溶かし、遮光のためにアルミホイルで包んで-20℃で保存する。
IPTG ( isopropyl-1-thio-D-galactoside)；2gを蒸留水8mlに溶かし、全量を10mlにメスアップして濾過滅菌し、1mlづつ分注して ｰ20℃で保存する。

プロトコール：

(1)　大腸菌転換受容菌単集落を１ー５ｍｌのＬＢに移植し、３７℃で一晩培養する。
(2)　三角コルベン（300 ｰ500ml容）に入った５０ｍｌのＬＢにこの培養液の１ｍｌを混釈する。３７℃で２ー３時間激しく振盪培養する。（後期対数増殖期を越えてはならない）直ちに氷冷する。（この後、菌は常に冷却されていなければならない！）
(3)　50mlポリプロピレン・チューブに移し、５分間遠心集菌する。（４℃、4000rpm、1600g）
(4)　上清を捨て、氷冷した１０ｍｌの塩化カルシウム溶液を加え懸濁する。
(5)　５分間遠心集菌する。（４℃、3000rpm、1100g）
(6)　(4)と(5)を繰り返す。菌の沈渣に氷冷した２ｍｌの塩化カルシウム溶液に懸濁する。（コンピテントセル）
(7)　得られた菌懸濁液の１００μｌを微量遠心チューブに移し、１ー２μｌのプラスミドＤＮＡ溶液(0.1-100ng）を加える。対照としてＤＮＡを含まないコンピテントセルのみのチューブも用意する。そして、それぞれを４℃、３０分氷冷する。
(8)　熱処理を４２℃、１分行う。
(9)　１ｍｌのＬＢ培地を加え、３７℃で１時間培養する。
(10)　これらの培養の１０、１００μｌを選択培地上に塗抹する。（対照のものは２００μｌを選択培地上に塗抹する）