DNAシークエンシング

　DNA塩基配列決定は、ヌクレオチドアナログ（ddNTPs）とDNAポリメラーゼを用いたダイデオキシ（dideoxy）法で決定するのが一般的である。DNA鎖はDNAポリメラーゼにより、dNTPが取り込まれて伸長するが、アナログであるddNTPが取り込まれるとその後のDNA鎖の伸長が阻害される。したがって、DNA合成の際に少量のddNTPが含まれていると、合成の途中でddNTPがある確率で取り込まれ、いろいろな長さの合成産物ができる。これらを電気泳動によって長さによって分別し、塩基配列を決定する。この反応にはTaqDNAポリメラーゼを用い、PCRにより標識を行う。標識方法はダイデオキシ・ターミネーション法と呼ばれるもので、４種のddNTP（ddATP、ddCTP、ddGTP、ddTTP）にそれぞれ異なる蛍光色素が付加されており、一本のチューブの中で４つの標識反応を行わせることが可能である。標識されたDNA断片はシークエンサーで泳動することにより、自動的に塩基配列が取得できる。
以下の方法では、アプライド・バイオシステム社のBig Dye terminator cycle sequencing kitを用いている。

シークエンス標識反応

(1)　0.2mlチューブに以下のものを加える（トータル20μl）。

DNA（ng） ----------------------- xμl
Sequencing reagent mix ------ 4μl
M13 primer (3.2 pmol) -------- 1μl
H2O ------------------------------- (15 - x )μl

(2)　サーマルサイクラー（DNA増幅装置）にセットし、プログラムをスタートさせる。

96℃ - 10秒、50℃ - 5秒、60℃ - 4分（これを25回繰り返す）

(3)　2M酢酸ナトリウム溶液(pH 4.5)を2μl、95%エタノールを50μl加えてよく混ぜる。

(4)　氷上に10分間放置。
(5)　14000rpm、室温で20分間遠心し、注意深く上澄みを捨てる。
(6)沈殿に70％エタノールを200μl加え、14000rpm、室温で10分間遠心する。
(7)　エタノールを捨て、沈殿を乾燥させ、20μlのＴＳＲに懸濁する。
(8)　シークエンサー用チューブに移し、95℃で２分間加熱し、氷上で急冷する。