シークエンス用プラスミドDNA調整法

準備：
ＴＢ液体培地
アンピシリン溶液（50mg/ml）；100μl/100ml培地（終濃度50μg/ml）
GTE溶液（525mM Tris-HCl, pH8.0; 10mM EDTA; 50mMグルコース）
アルカリ・SDS溶液（0.2M NaOH, 1% SDS）；当日調整、作り置きはしない
酢酸カリウム溶液（3Ｍ酢酸カリウム溶液；pH4.8）；氷冷しておく
13%　PEG6000溶液（オートクレーブしておく）
クロロフォルム
イソプロパノール
70％エタノール
滅菌蒸留水
４Ｍ塩化ナトリウム
RNaseＡ溶液（10mg/ml）；Dnaseを失活させるために100℃、10分間煮沸する。

プロトコール：

1. 大腸菌形質転換体をアンピシリンの入った２mlのＴＢ（試験管）に移植し、３７℃で一晩激しく振盪培養する。（撹拌が不十分なときはプラスミドの収量が悪くなる）
2. 1.5ｍｌをエッペンドルフ・チューブに移し、6000rpm、１分間遠心集菌する。
3. 上清を捨て、200μlのGTE溶液を加え懸濁する。
4. さらに300μlのアルカリ・SDS溶液を加え穏やかに混ぜ、氷中に５分間置く。（この時、激しく懸濁すると回収されるプラスミドＤＮＡに大腸菌染色体ＤＮＡがコンタミする）
5. 氷冷した酢酸カリウム溶液を300μl加え、チューブを倒置して懸濁し、氷中に５分間置く。そして6000rpm、室温で10分間遠心。
6. 上清を新しいエッペンドルフ・チューブに移し、2μlのRNaseＡ溶液を加え、37℃で20分放置。
7. クロロフォルムを300μl加え、チューブを倒置して懸濁し、12000rpm、10分間遠心する。
8. 上清を新しいエッペンドルフ・チューブに移し、再びクロロフォルムを300μl加え、チューブを倒置して懸濁し、12000rpm、10分間遠心する。
9. イソプロパノールを600μl加え、チューブを倒置して懸濁し、14000rpm、室温で10分間遠心する。
10. イソプロパノールを捨て、70%エタノールを500μl加え、14000rpm、10分間遠心する。
11. エタノールを捨て、沈殿を乾燥させる。
12. 滅菌蒸留水を32μl、4M塩化ナトリウムを8μl、13%　PEG6000溶液を40μl加え、よく撹拌し、氷上に20分置く。
13. 14000rpm、4℃で15分間遠心し、注意深く上澄みを捨てる。沈殿に70％エタノールを加え、14000rpm、4℃で15分間遠心する。
14. エタノールを捨て、沈殿を乾燥させ、20μlのHPLC水に懸濁する。
15. DNA濃度を測定する。