高効率コンピテントセル作製法

　Hanahan法によるコンピテントセルの作製法よりは簡便であり、その形質転換効率も高い。以下の方法はオリジナルに多少の修正を加えている。

〜出典〜
バイオマニュアルシリーズ２、遺伝子ライブラリーの作成法　野島博（編）、p19-26、羊土社
High efficiency transformation of Escherichia coli with plasmids.  Inoue H, Nojima H, Okayama H. Gene.(1990) vol.96 (1): 23-28.

１.コンピテントセルの調製

準備：

ＳＯＢ培地
ディフコのＳＯＢ粉末を200mlのHPLC水に溶かしたものを２Ｌの三角コルベンに入れ、オートク レーブする。
Transformation buffer (TB)
　　　PIPES ------------------------------ 1.5 g
　　　CaCl2・H2O ---------------------- 1.1 g
　　　KCl --------------------------------- 9.3 g
　　　　　400mlのHPLC水に懸濁後、5M KOHでpHを6.7〜6.8に合わせる。
　　　　　つぎに、MnCl2・4H2Oを5.45 g添加し、500mlにメスアップし、ろ過滅菌する。
　　　　　４℃保存。
５００mlの遠沈管
３０mlの遠沈管
液体窒素

方法：

(1)　ー８０℃から取り出した大腸菌（DH5a）をＬＢ培地にストリークし、３７℃で一晩培養。
(2)　１〜３mm径のコロニーをまず、１mlのＳＯＢに懸濁し、それを２００mlのＳＯＢ培地の入った２Ｌの三角コルベンに移す。
(3)　シェーカーで激しく振とうし、１８℃で１９〜５０時間培養する。
(4)　ＯＤ600＝０.４〜０.８に達したら、培養を止め直ちに氷中にて、１０分間冷却する。
(5)　培養液を５００mlの遠沈管に移し、４℃で３０００ｒｐｍ、１５分間遠心する。
(6)　上静を除いた後、６０mlの氷冷ＴＢに懸濁し、さらに氷中で１０分間冷却する。
(7)　４℃で３０００ｒｐｍ、１５分間遠心する。
(8)　上静を除いた後、１６mlの氷冷ＴＢに懸濁し、３０mlの遠沈管に移し、さらに１.２mlのＤＭＳＯ（最終濃度７％）を添加し、氷中で１０分間冷却する。
(9)　０.５mlづつ１.５mlチューブに分注し、直ちに液体窒素に浸し凍結させる。
(10)　ー８０℃で保存する。

２.形質転換操作

準備：

ＳＯＣ
　　　ＳＯＢ培地に２Ｍグルコースを1/100加える。
ＬＢ+アンピシリン寒天培地
X-gal、IPTG：必要に応じて。

方法：

(1)　ー８０℃から取り出したコンピテントセル手のひらの中で融解後、氷中に置く。
(2)　５０mｌずつ、１.５mlチューブに分注し、〜２.５mｌのＤＮＡサンプルを加え、氷中で３０分間冷却する。
(3)　４２℃のヒートブロック中で１分間保持し、氷中で２分間冷却する。
(4)　２００mｌのＳＯＣ液体培地を加え、３７℃で１時間培養する。
(5)　ＬＢ+アンピシリン寒天培地にストリークし、３７℃で一晩培養する。