ゲノムDNAの調整法（ラージスケール）

準備：

SPEM (1M ソルビトール, 0.5mM Na2HPO4,:pH 7.2, 0.5mM EDTA:pH 8.0)
2-メルカプトエタノール
Zymolyase 20T (10mg/ml)
10% SDS
プロテナーゼ K
フェノール:クロロホルム(1:1)
クロロホルム
6M 酢酸アンモニウム(pH 7.6)
99.5%エタノール
70%エタノール
50ml遠沈管

方法：

1. 30mlの液体培地で28℃で一晩振盪培養する
2. 50mlの遠沈管に移し、3000rpmで5分間遠心し、集菌する。
3. 上清を捨て、20mlの 50mM EDTA (pH 7.5)に懸濁し、3000rpmで5分間遠心し、集菌する。
4. 上清を捨て、20ml のSPEMを加えて懸濁し、2-メルカプトエタノールを40 μl、Zymolyase 20T (10mg/ml)を100 μl加え、37℃で１時間以上穏やかな振盪を与えながら反応させる。
   ＊菌体の固まりが生じる
5. さらに1mgのプロテナーゼ Kと2mlの10% SDSを加え、50℃で1時間反応させる。
   ＊溶液が透き通ってくる。
6. 等量のフェノール:クロロホルム(1:1)を加え、穏やかにまぜ、3000rpmで10分間遠心する。
7. 上層を先の太いピペットで慎重にとり、新しい50mlのチューブに移す。
   ＊中間層を取らないように注意する。
8. 等量のクロロホルムを加え、穏やかにまぜ、3000rpmで10分間遠心する。
9. 上層を先の太いピペットで慎重にとり、新しい50mlのチューブに移す。
   ＊(8)-(9)の操作を上層が透明になるまで行う。
10. 1/10量の6M 酢酸アンモニウム(pH 7.6)と2倍量の冷99.5%エタノールを加え、穏やかに混ぜる。
11. -20℃で１時間放置し、白いまゆ状になったDNAを確認した後、3000rpmで10分間遠心する。
12. 70%エタノールで洗浄し、半乾きの状態で3mlのTE buffer に懸濁する。